habari

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ni analog ya substrate ya β-galactosidase, ambayo inaweza kuingizwa sana.Chini ya uingizaji wa IPTG, inducer inaweza kuunda tata na protini ya mkandamizaji , Ili uundaji wa protini ya ukandamizaji ubadilishwe, ili hauwezi kuunganishwa na jeni la lengo, na jeni inayolengwa inaonyeshwa kwa ufanisi.Kwa hivyo ukolezi wa IPTG unapaswa kuamuliwa vipi wakati wa jaribio?Je, kubwa ni bora zaidi?
Kwanza, hebu tuelewe kanuni ya uingizaji wa IPTG: Opereni ya laktosi ya E. coli (elementi) ina jeni tatu za muundo, Z,Y, na A, ambazo husimba β-galactosidase, permease, na acetyltransferase, mtawalia.lacZ hidrolisisi lactose katika glucose na galaktosi, au katika allo-lactose;lacY inaruhusu lactose katika mazingira kupita kwenye membrane ya seli na kuingia ndani ya seli;lacA huhamisha kikundi cha asetili kutoka asetili-CoA hadi β-galactoside, ambayo inahusisha kuondoa athari ya Sumu.Kwa kuongeza, kuna mlolongo wa uendeshaji O, mlolongo wa kuanzia P na jeni la udhibiti I. Nambari ya jeni I ni protini ya mkandamizaji ambayo inaweza kumfunga kwa nafasi ya O ya mlolongo wa operator, ili operon (meta) inakabiliwa na imezimwa.Pia kuna tovuti inayoshurutisha kwa kianzisha jeni cha kikataboliki tovuti inayofunga protini-CAP juu ya mkondo wa mfuatano wa P. Mfuatano wa P, Mfuatano wa O na tovuti ya kuunganisha CAP pamoja huunda eneo la udhibiti wa lac operon.Jeni za usimbaji za vimeng'enya vitatu hudhibitiwa na eneo moja la udhibiti ili kufikia usemi ulioratibiwa wa bidhaa za jeni.

Kwa kutokuwepo kwa lactose, lac operon (meta) iko katika hali ya ukandamizaji.Kwa wakati huu, kikandamizaji cha lac kilichoonyeshwa na mfuatano wa I chini ya udhibiti wa mfuatano wa kikuzaji cha PI hufunga kwa mfuatano wa O, ambao huzuia RNA polymerase kutoka kwa kuunganisha kwa mlolongo wa P na kuzuia uanzishaji wa unukuzi;wakati lactose iko, lac operon (meta) inaweza kuingizwa Katika mfumo huu wa operon (meta), inducer halisi si lactose yenyewe.Lactose huingia kwenye seli na kuchochewa na β-galactosidase kubadilishwa kuwa allolactose.Mwisho, kama molekuli ya kichochezi, hufunga kwa protini ya kikandamizaji na kubadilisha muundo wa protini, ambayo husababisha kutengana kwa protini ya kikandamizaji kutoka kwa mlolongo wa O na maandishi.Isopropylthiogalactoside (IPTG) ina athari sawa na allolactose.Ni inducer yenye nguvu sana, ambayo haijatengenezwa na bakteria na ni imara sana, hivyo hutumiwa sana katika maabara.

Jinsi ya kuamua mkusanyiko bora wa IPTG?Chukua E. koli kama mfano.
Aina ya E. coli BL21 iliyobuniwa kwa vinasaba iliyo na pGEX (CGRP/msCT) chembe chembe chanya ilichanjwa kwenye kioevu cha LB kilicho na 50μg·mL-1 Amp, na kukuzwa usiku mmoja kwa 37°C.Utamaduni ulio hapo juu ulichanjwa katika chupa 10 za 50mL safi ya kioevu ya LB iliyo na 50μg·mL-1 Amp kwa uwiano wa 1:100 kwa utamaduni wa upanuzi, na wakati thamani ya OD600 ilikuwa 0.6~0.8, IPTG iliongezwa kwenye mkusanyiko wa mwisho.Ni 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol · L-1.Baada ya kuingizwa kwa joto sawa na wakati huo huo, 1 mL ya ufumbuzi wa bakteria ilichukuliwa kutoka humo, na seli za bakteria zilikusanywa kwa centrifugation na chini ya SDS-PAGE kuchambua ushawishi wa viwango tofauti vya IPTG kwenye kujieleza kwa protini, na kisha. chagua mkusanyiko wa IPTG na usemi mkubwa zaidi wa protini.
Baada ya majaribio, itapatikana kuwa mkusanyiko wa IPTG sio mkubwa iwezekanavyo.Hii ni kwa sababu IPTG ina sumu fulani kwa bakteria.Kuzidi mkusanyiko pia kutaua kiini;na kwa ujumla, tunatarajia kwamba protini zaidi ya mumunyifu iliyoonyeshwa kwenye seli, ni bora zaidi, lakini katika hali nyingi wakati mkusanyiko wa IPTG ni wa juu sana, kiasi kikubwa cha kuingizwa kitaundwa.Mwili, lakini kiasi cha protini mumunyifu kilipungua.Kwa hiyo, mkusanyiko unaofaa zaidi wa IPTG mara nyingi sio bora zaidi, lakini ukolezi wa chini.
Madhumuni ya kuingiza na kukuza aina zilizoundwa kijeni ni kuongeza mavuno ya protini inayolengwa na kupunguza gharama.Usemi wa jeni lengwa hauathiriwi tu na sababu za aina yenyewe na usemi wa plasmid, lakini pia na hali zingine za nje, kama vile mkusanyiko wa kishawishi, joto la induction na wakati wa induction.Kwa hiyo, kwa ujumla, kabla ya protini isiyojulikana imeonyeshwa na kutakaswa, ni bora kujifunza wakati wa induction, joto na mkusanyiko wa IPTG ili kuchagua hali zinazofaa na kupata matokeo bora ya majaribio.